pH 值優化：抗體剝離緩沖液的弱堿性 pH 值（通常在 8.0 - 9.0）是影響剝離效果的關鍵。對于結合力強的抗體，可將 pH 值微調至 9.0，增強對離子鍵和氫鍵的破壞能力，但需注意避免過度堿性導致蛋白質變性。膜再生液的 pH 調節劑也需精準控制，使其與后續抗體孵育的 pH 環境相適配，一般維持在 7.4 - 7.6 為宜，可通過 pH 計實時監測并校準。

成分濃度調控：根據抗體 - 抗原結合強度，調整剝離緩沖液中變性劑（如 SDS）和表面活性劑（如 Tween - 20）的濃度。對于普通抗體，低濃度 SDS（0.1% - 0.5%）即可滿足剝離需求；若抗體結合緊密，可將 SDS 濃度提升至 1%，但需縮短剝離時間，防止蛋白質過度變性。膜再生液中復性劑（如甘油）和抗氧化劑（如 DTT）的濃度也需優化，過高濃度的 DTT 可能影響某些蛋白質的結構，建議在 0.5 - 1 mM 范圍內進行梯度實驗，確定最佳濃度 。

溫度與時間控制：嚴格保持抗體剝離和膜再生過程在室溫（20 - 25℃）下進行，避免溫度波動影響反應速率和蛋白質穩定性。剝離時間需根據抗體類型和結合強度靈活調整，對于多克隆抗體，常規 10 - 15 分鐘即可；單克隆抗體若結合緊密，可延長至 15 - 20 分鐘，但不超過 20 分鐘。膜再生時間一般為 15 - 20 分鐘，確保蛋白質充分復性，但過長時間可能引入雜質，影響后續實驗。

振蕩方式與強度：在抗體剝離和膜再生過程中，采用緩慢、勻速的振蕩方式，確保膜與液體充分接觸，同時避免劇烈振蕩導致膜的物理損傷。可選擇水平搖床，設置轉速在 50 - 80 rpm，既能保證液體均勻流動，又不會對膜上蛋白質造成破壞。

膜類型差異處理：不同類型的轉印膜（如 NC 膜、PVDF 膜）對剝離和再生條件的耐受性不同。NC 膜質地較脆，對強堿性和高濃度變性劑敏感，宜采用更低濃度的剝離緩沖液和更短的處理時間；PVDF 膜化學穩定性強，可適當提高剝離緩沖液濃度或延長處理時間。在處理前，可通過預實驗摸索不同膜類型的最佳條件 。

膜孔徑選擇與處理：膜的孔徑大小影響蛋白質與膜的結合牢固程度及抗體剝離難度。對于大分子蛋白質，選擇孔徑較大的膜（如 0.45 μm），剝離時需適當增加緩沖液作用時間；小分子蛋白質（<20 kDa）則適用小孔徑膜（0.2 μm），剝離條件可相對溫和。此外，新膜在使用前可進行預活化處理（如 PVDF 膜用甲醇浸泡），提高蛋白質結合能力，也有助于后續的剝離和再生操作。

抗體預處理：在抗體孵育時，降低抗體濃度或縮短孵育時間，可減少抗體與抗原的結合量，使后續剝離過程更輕松。同時，選擇親和力適中的抗體，避免使用過高親和力的抗體，防止剝離困難。

多次分步處理：對于難以剝離的抗體，可采用多次分步剝離的方法，每次使用較低濃度的剝離緩沖液，短時間處理后洗滌，重復 2 - 3 次，逐步去除抗體，既能保證剝離效果，又能保護蛋白質 。在膜再生環節，也可進行二次再生處理，進一步恢復膜的性能。